2021年12月24日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心张余研究团队和王佳伟研究团队以及澳门·新葡萄新京6663冯钰团队合作在《科学》上发表题为“Pol IV and RDR2: A two-RNA-polymerase machine that produces double-stranded RNA”的研究论文，该研究首次解析了植物Pol IV的结构，揭示了植物Pol IV-RDR2两种RNA聚合酶组装成的独特复合物构造，并提出了Pol IV-RDR2以底物内部传递的机制实现双链DNA为模板合成双链RNA。
研究背景：
转座子（transposon）最早由美国的遗传学家Barbara McClintock（1983年诺贝尔生理和医学奖）在玉米中发现，在细菌、病毒以及真核生物的基因组中广泛分布。转座子类似内源性病毒，能够在宿主基因组中“复制和粘贴”自己的DNA，以达到其自我“繁殖”的目的。活跃的转座子对基因组的稳定构成严重威胁，高等生物通过对转座子DNA进行甲基化修饰将其沉默来维持基因组的稳定性。
RNA导向的DNA甲基化（RdDM）途径是高等植物基因组甲基化的重要途径。在该途径中，植物独有的两个RNA聚合酶（Pol IV和Pol V）发挥了核心作用。Pol IV与RDR2合作产生小干扰RNA的dsRNA前体，经过加工后形成24个碱基的小干扰RNA，随后这些小干扰RNA在Argonaut蛋白的帮助下与RNA聚合酶Pol V产生的scaffold RNA配对，从而招募DNA甲基转移酶（DRM2）完成DNA的甲基化。
高等植物中经典的RdDM途径通路 (1)
Pol IV和Pol V作为真核生物的第四个和第五个多亚基RNA聚合酶，其基因转录区域、转录起始、延伸和终止机制、转录调控方式均和Pol I、 Pol II和Pol III有较大区别。Pol IV转录的独特之处在于， Pol IV能够与RDR2形成复合物，直接以双链的基因组DNA为模板催化dsRNA的合成。虽然植物Pol IV和Pol V于2005年被发现，然而其三维结构仍然未被报导，大大阻碍了Pol IV和Pol V的进一步深入研究。
研究过程：
在该工作中，研究人员克服了低丰度超大蛋白质复合物的制备瓶颈，通过拟南芥的悬浮细胞体系纯化了内源的Pol IV-RDR2复合物，随后通过冷冻电镜单颗粒重构技术，解析了Pol IV-RDR2全酶和Pol IV-RDR2转录延伸复合物冷冻电镜结构，并结合生物化学和遗传学实验进一步阐明了Pol IV和RDR2协作的分子机制。
Pol IV-RDR2全酶的复合物结构（左）以及Pol IV-RDR2 转录延伸复合物（右）的三维结构
三维结构支持Pol IV由Pol II进化而来，然而几亿年的进化使Pol IV的催化中心和外部结构单元与Pol II有所不同。首先，Pol IV蛋白的外部结构单元不能与TFIIB， TFIIE以及TFIIF等Pol II 特异转录起始因子相互作用，从而保证了Pol IV与Pol II的转录相互独立。其次， Pol IV催化中心的核心元件发生变化，提示Pol IV转录过程容易发生停滞和倒退。
该研究最有意义的发现在于Pol IV和RDR2形成一个稳定的复合物，并且这两个聚合酶的催化中心由一个内部的通道相连接，Pol IV以双链DNA为模板合成的单链RNA通过这个内部通道直接传递给RDR2，从而RDR2能够以这条单链RNA为模板输出双链RNA。据此，研究人员提出了Pol IV-RDR2复合物以RNA内部传递的机制实现双链DNA为模板合成双链RNA的模型。首先Pol IV在基因组DNA上前进，以双链DNA为模板合成一定长度的单链RNA，在转录延伸过程中由于染色体的多重障碍以及Pol IV的内在性质导致Pol IV转录暂停并发生倒退，在Pol IV倒退的过程中，Pol IV合成的单链RNA从内部通道进入RDR2的催化中心，该单链RNA随后被RDR2用作模板合成双链RNA。RDR2在合成双链RNA的过程中会促使Pol IV合成的单链RNA逐渐从Pol IV 的催化中心解离，最后RDR2完成双链RNA的合成和释放。上述特殊的作用机制能够保证 Pol IV合成的单链RNA直接传递至RDR2，防止单链RNA的降解，另外，Pol IV-RDR2经过一轮双链RNA合成之后，又回到转录起点，能够开始下一轮双链RNA合成，高效地实现了双链RNA的扩增。
Pol IV-RDR2的三维结构以及二者高效合作合成双链RNA的机制
这项工作首次揭示了真核生物第四个多亚基RNA聚合酶的三维构造，阐明了两种RNA聚合酶Pol IV和RDR2协作转录的独特分子机制，回答了RdDM途径中双链RNA如何合成的科学问题。这一研究结果拓展了真核生物RNA聚合酶结构和功能的多样性，加深了我们对植物表观遗传机制的理解。
高等生物RNA聚合酶
该论文由分子植物卓越中心黄坤、武霄仙、方城力和徐洲更为共同第一作者，张余研究员、王佳伟研究员和澳门·新葡萄新京6663冯钰研究员为共同通讯作者。本课题受到国家自然科学基金、中国科学院先导科技专项、上海市基础研究特区计划项目和中科院重点部署项目的资助。
