DNA复制是遗传信息传递和生命延续的关键过程。然而，细胞内外的代谢活动及多种损伤因素可能引发复制压力，干扰DNA复制的正常进行，导致基因组不稳定性，并诱发多种疾病。为应对复制压力，细胞演化出多种保护机制以维护基因组的完整性和稳定性。其中，复制叉翻转（fork reversal）是一种在进化中高度保守的策略。在这一过程中，新合成的子链DNA与母链分离并翻转，两条子链相互配对，同时母链重新结合，使复制叉回退，从“三链”结构转变为“四链”结构。通过这一机制，复制叉在复制压力下得以保持动态平衡，避免崩塌，从而在高等真核生物中维持基因组稳定性。

当复制压力解除后，翻转复制叉必须重新启动以完成DNA复制。DNA2作为一种结构特异性核酸酶，在复制叉重启中发挥核心作用。DNA2通过适度切割翻转复制叉上翻转臂的5’DNA末端，生成足够长度的3’DNA突出（3’overhang），为依赖同源重组的复制叉重启提供必要的结构。然而，DNA2活性失控可能导致翻转臂的过度降解，从而引发复制叉崩塌和基因组不稳定。因此，复制压力应答过程中需要精准调控DNA2的活性：一方面细胞需要需避免DNA2对翻转复制叉末端的过早切割以维持其稳定；另一方面又需激活DNA2以有效加工翻转复制叉，保证后续复制叉重启的顺利进行。然而，这一过程中DNA2活性的动态调控机制仍未得到明确解析。

传统观点认为，BRCA1/2蛋白通过招募RAD51形成核纤丝，保护翻转复制叉暴露的末端免受DNA2、MRE11等核酸酶降解。在BRCA1/2缺陷细胞中，由于复制叉保护机制受损，细胞对复制压力的耐受性显著降低。这一缺陷导致BRCA1/2缺陷细胞对PARP抑制剂（PARPi）表现出上千倍的高敏感性，成为PARPi治疗肿瘤的基础。仅依赖BRCA1/2-RAD51的保护是否足以维持翻转复制叉的稳定性？部分PARPi耐药病人并未出现BRCA1/2功能的恢复，或许提示了其它未知保护机制存在的可能性。

2024年12月19日，澳门·新葡萄新京6663刘婷团队在 Molecular Cell 杂志在线发表题为Dynamic Control of RNA-DNA Hybrid Formation Orchestrates DNA2 Activation at Stalled Forks by RNAPII and DDX39A 的研究论文。这项研究首次鉴定出一段RNA-DNA杂交链为翻转复制叉的重要保护因子，揭示了不同于BRCA1/2-RAD51的翻转复制叉末端保护机制。通过揭示 RNAPII-DDX39A 轴对 RNA-DNA 杂交链丰度的动态调控，该研究阐明了 RNA-DNA 杂交链在保护翻转复制叉免受 DNA2 过度降解中的关键作用，以及通过 DDX39A 移除 RNA 链，有序激活 DNA2 以促进复制叉重启，从而维持基因组稳定性的机制。

研究团队在翻转的停滞复制叉上发现了 RNA-DNA 杂交链，并通过 dot blot、PLA、EdU 偶联染色质免疫沉淀及链特异性 DNA 和 RNA 测序（EipNA-seq）等技术，证实该杂交链中的 RNA 是以后滞链为模板，在新生 DNA 的前导链上合成的。进一步研究表明，这一RNA-DNA 杂交链的合成由 RNA 聚合酶 II（RNAPII）介导完成。而解旋酶DDX39A特异性解旋该杂交链，移除RNA，招募DNA2对翻转复制叉末端进行加工，促进复制叉重启。

通过抑制RNAPII或过量表达DDX39A以降低停滞复制叉处杂交链的丰度，研究者观察到复制叉被DNA2切割后过度降解并崩塌，同时伴随大量DNA损伤信号的积累。这一结果表明，RNA-DNA杂交链在复制压力未解除时能够有效抑制DNA2的过早降解，从而避免复制叉崩塌和DNA损伤，确保基因组稳定性。

该研究表明，除了经典的 BRCA1/2-RAD51 介导的保护作用外，RNA-DNA 杂交链也在翻转复制叉末端的保护中发挥了重要作用。研究人员证实，在 DDX39A 缺失的情况下，RNA-DNA 杂交链得以持续存在，从而保护复制叉，部分恢复了 BRCA1/2 缺陷细胞的复制叉稳定性，导致这些细胞对 PARP 抑制剂（PARPi）产生耐药性。通过对 TCGA 数据库的分析，进一步揭示了这一机制与 BRCA1/2 缺陷卵巢癌患者接受铂类药物化疗后不良预后之间的关联。这一发现提示，DDX39A 的表达水平可能成为化疗药物疗效的潜在预测指标。此外，通过采用特异性策略阻断 RNA-DNA 杂交链对翻转复制叉末端的持续保护，有望逆转由此机制引发的 PARPi 耐药问题。

综上所述，这项研究的发现不仅拓展了我们对复制压力应答机制的认识，也为靶向复制叉动态调控以开展肿瘤精准治疗提供了新的思路，尤其是为克服BRCA1/2缺陷癌症中的PARPi耐药性提供了潜在的治疗策略。

澳门·新葡萄新京6663刘婷教授为本文通讯作者，澳门·新葡萄新京6663博士生宋礼志、谢海华、樊浩楠、博士后张燕君、已毕业博士生程子修为本文共同第一作者。该研究工作还得到了澳门·新葡萄新京6663方东教授团队、黄俊教授团队和澳门·新葡萄新京6663医学院附属第二医院周建维教授团队的大力支持。

刘婷课题组长期致力于研究DNA损伤应答与基因组不稳定性的分子机制，通过基础研究与疾病模型相结合的方法，深入探讨与DNA损伤应答相关疾病的分子机制，并探索更有效的靶向治疗策略。研究成果发表于Science、Molecular Cell、Nat Chem Biol、Nat Commun、Proc Natl Acad Sci U S A、EMBO J、Cell Rep、EMBO Rep.等知名学术刊物，诚邀对该领域有兴趣的学生、博士后、技术员等加盟。课题组详细信息请见网站https://person.zju.edu.cn/tliu，申请可发至liuting518@zju.edu.cn。